2021年上海企退人员抗议（上海抗议退休金双轨制）

因此，首先将287个成分靶点与199个疾病靶点进行关联，筛选得到42个重叠的靶点，即为YXST治疗冠心病的直接作用靶点，结果见图2。

紫外-可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司。RGD是一种靶向分子，可特异性识别琢淄茁3整合素受体，因此，增加靶向分子为纳米载药体系提供了指引的作用，使纳米载药体系与肿瘤细胞特异性结合从而提高治疗效果。

将得到的均相溶液置于100mL内衬为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，在200℃烘箱中反应10h。反应结束后，冷却至室温，在12500r/min下离心20min，弃去上清液，重复清洗4次，最后用去离子水分散，超声处理8h，4500r/min离心10min后，取上清液，除去底部大尺寸的二硫化钼，将得到的上清液用透析袋（8000~14000Da）除杂，即可得到二硫化钼纳米片分散液。为了验证DOX是通过共价连接MPRS，采用紫外-可见分光光度计检测MPRS、DOX、MPRS-DOX在800～200nm波长范围内的紫外-可见光谱。ZetasizerNanoZS纳米粒度电位仪，英国马尔文仪器有限公司。1.2 方法1.2.1 MoS2的制备MoS2纳米片的制备参考文献中的制备方法，将2.336g钼酸铵四水和5.057g硫脲溶解在70mL的去离子水中，并用超声助溶形成均相溶液。

本文设计了一种靶向MoS2纳米载药体系，以MoS2纳米片为基底，硫辛酸聚乙二醇羧酸（LA-PEG-COOH）为接枝连接靶向分子RGD，之后连接上SPDP，得到MoS2-PEG-RGDSPDP（MPRS）纳米载体。二硫化钼不仅具有较大的比表面积，而且其组成元素Mo是细胞中几种酶的必需微量元素，S是一种常见的生物元素。我国内蒙古、广东、贵州、江西、浙江、云南、吉林、甘肃、福建等地均有马铃薯粉痂病的发生，国外许多国家和地区，如以色列、美国、巴基斯坦、哥斯达黎加、韩国、意大利等均有报道。

马铃薯粉痂病（Potato powdery scab）是由粉痂菌（Spongospora subterranea f. sp.subterrane）引起的真菌性病害，主要危害根部和块茎，也可使茎染病。马铃薯粉痂病能使马铃薯产量减少10%～20%，重者可达到 50%。粉痂菌以休眠孢子囊球随种薯或病残体越冬。1 材料与方法1.1 供试菌株试验所用的粉痂菌（S. subterranea）、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、葫芦科刺盘孢菌（Colletotrichum lagenarium）、尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum）、大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄匍柄霉菌（Stemphylium solani）、疫霉菌（Phytophthora infestans）、多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）、细极链格孢菌（Alternariatenuissima）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、疮痂链霉菌（Streptomyces scabies）均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所分离保存（表 1）。

和一对实时荧光定量 PCR 的特异性引物 QF: 5'-GCAACTAAATAAAATTTAATGCTAAAAGTG-3'，QR:5'-TTTGTACGCTAAGTTCGATAGGAG-3'，扩增产物大小为 104 bp（图 1）。近年来，由于 PCR 技术更加快速、准确、便捷而被广泛应用于病原菌的检测和定量研究。

Graff 等根据马铃薯粉痂菌内部转录间隔区设计了一对大小为 61 bp 的特异性引物 SsTQF1/SsTQR1 和一个荧光 Taqman探针 SsTQP1，可以检测和定量悬浮在水中或与粘土混合的休眠孢子堆。由于粉痂菌不能人工培养，国内对马铃薯粉痂菌检测的研究较少，其防治药剂效果也较差，因此，针对马铃薯粉痂菌，亟需建立快速、灵敏、准确性高的检测方法，为该病害的早期监测和预防提供重要依据。已报道的土壤带菌量的检测方法有诱饵法、ELISA 法和 PCR 检测。Nian 等通过建立实时荧光定量 PCR 体系从而快速准确鉴定了小麦黑穗菌（Tilletia controversa Khn），应用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。

混有休眠孢子囊的菌土和田间土壤总 DNA 提取采用 TIANamp Soil DNA Kit 土壤基因组 DNA 提取试剂盒提取土壤总 DNA。Hui 等以番茄幼苗作为诱饵，检测到马铃薯重茬 0～10 cm 土壤中的马铃薯粉痂病菌。Guo 等[21]通过筛选不同疮痂菌的通用探针，建立了马铃薯疮痂菌的快速 PCR 检测方法，实现了对病组织和土壤样品的快速检测。本研究通过筛选特异性好、稳定性高的粉痂菌特异性引物，建立马铃薯粉痂病快速检测体系，以期为马铃薯粉痂病的早期预警提供技术支持。

1.2 DNA 提取马铃薯粉痂病斑或培养基平板上培养一周的菌丝体，采用植物基因组 DNA 提取试剂盒提取植物基因组或病原菌基因组 DNA。针对在生产中马铃薯粉痂病危害严重，缺乏病原菌快速检测的方法的情况。

病薯和土壤中病残体为病害的初侵染源，远距离传播主要依靠种薯，田间传播主要通过浇水、病土、病肥等。NanoDrop 2000定量 DNA 浓度，保存于-20℃备用。

但是番茄幼苗诱饵法只能检测到土壤中粉痂病菌活的游动孢子，无法检测到休眠孢子且检测时间较长、操作繁琐。1.3 引物设计根据 NCBI GenBank 中已登记的马铃薯粉痂菌及其他非靶标菌的标准菌株基因序列（表2），利用DNAMAN 8.0 软件比对，选取粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA 的保守区域，设计了两对应用于普通 PCR 的特异性引物 A5: 5'-ACAACTCTTAACAGTGG-3'，A9: 5'-AATGGTTAGAGACGAATC-3'，C3: 5'-AATCTAGAGCACCCCGTTTTCATTCG-3'，C8: 5'-TGCGCAAACCTTAATACGGGAA-3'，扩增产物大小分别为 281 和 391bp。鉴于目前缺乏对马铃薯粉痂菌快速、准确的检测方法，本研究基于马铃薯粉痂菌内部转录间隔区和线粒体 DNA，分别设计了适用于初步检测的普通PCR 特异性引物和实时荧光定量 PCR 特异性引物，建立了快速、高灵敏性的检测体系。Qu 等[24]根据马铃薯粉痂菌内部转录设计了大小为 434 bp SSF/SSR 引物，该研究成功地应用于有无粉痂病症状的带菌马铃薯块茎的检测，可以检测到1/g土的孢子球。Liu 等利用棉花黄萎病的病原菌菌丝蛋白作为抗原，制备该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体，建立特异性检测棉花黄萎病菌的间接 ELISA 方法，但由于真菌结构与物质组成复杂,寻找特异性抗原有很大难度。引物均由北京博迈德基因公司合成

2.3 标准曲线的建立以不同稀释浓度的质粒DNA为模板，利用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增，结果表明，荧光 PCR 熔解峰单峰，标准曲线为 y=-3.8939x+35.228，R2=0.9966，该体系线性关系良好（图 5）。声明：本文所用图片、文字来源《植物病理学报》，版权归原作者所有。

挑取阳性克隆，转入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37℃、180 rmin-1振荡培养12 h后，提取重组质粒并进行PCR扩增，扩增产物送至北京博迈德生物公司测序，验证是否正确插入目的片段。吸取菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的 LB固体平板上，37℃培养 24 h。

1.7 标准曲线建立将阳性重组质粒 DNA 进行 10 倍梯度稀释，使用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增。扩增条件为 94 ℃预变性5min，94 ℃变性45s，55℃退火30s，72 ℃延伸45 ，35个循环。

标准曲线的横坐标和纵坐标分别设定为质粒浓度对数值和循环阈值，使用 Excel 2010 软件构建马铃薯粉痂菌荧光定量 PCR 标准曲线。1.4 引物特异性检测引物 A5/A9、C3/C8 对马铃薯粉痂菌基因组DNA及其他 11 个非靶标菌株基因组 DNA进行普通 PCR。质粒拷贝数=[质粒浓度（ngL-1）质粒体积（L）6.021023]/[（载体长度 bp+片段长度 bp）660 gmol-1]1.6 灵敏度检测使用NanoDrop 2000 紫外分光光度计，测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，再以 10倍梯度稀释，分别进行普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 扩增，根据有无扩增条带及荧光信号值大小，检测其灵敏度。1.5 重组质粒的制备马铃薯粉痂菌特异性引物 QF/QR 的扩增产物经回收纯化后，与 pEASY-T1 载体于 25℃连接，转入大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞中。

应用引物 QF/QR 进行实时荧光定量 PCR 扩增，结果表明该引物仅对马铃薯粉痂病菌有唯一的产物吸收峰（图 3）。1.8 田间土壤及罹病块茎组织样品检测及验证分别从云南省邵通市、甘肃省定西市和河北省张家口市采集 18份带菌土壤和18 份带菌种薯样品，按照 1.2 中的方法提取植物组织样品总 DNA，进行普通 PCR 和荧光 PCR 检测，计算检出率。

用测定质粒 DNA 浓度和纯度，根据摩尔定律，计算单位体积质粒所含的 DNA 拷贝数浓度。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系相关链接：土壤，马铃薯，DNA。

荧光 PCR 反应体系（20 L）为：2SuperReal PreMix Plus 10L，上下游引物（0.1 molL-1）各 0.5 L，50ROXReference Dye 0.4 L，模板 DNA（10 ngL-1）0.5 L，ddH2O 8.1 L。普通 PCR 反应体系（50L）为：2Taq PCR Master Mix 25 L，上下游引物（0.1 molL-1）各 0.5L，模板 DNA（10 ngL-1）0.5 L，ddH2O 23.5 L。

荧光 PCR 反应条件为 95℃预变性 15 min，95℃变性 10 s，60℃退火 32 s，40 个循环。引物 QF/QR 对马铃薯粉痂菌基因组 DNA 及其他 11 个非靶标菌株基因组DNA 进行荧光 PCR，ddH2O 作为阴性对照，检测引物的特异性。2.2 灵敏度检测利用引物 QF/QR 对不同浓度质粒 DNA 进行常规 PCR 和荧光定量 PCR 扩增，结果表明常规 PCR 灵敏度为 1.38104 fgL-1，荧光定量 PCR 灵敏度为 13.8 fgL-1，是常规 PCR检测灵敏度的 1000 倍（图 4）。2 结果与分析2.1 引物特异性验证应用引物 A5/A9 和 C3/C8 对马铃薯粉痂病菌和其它 11 株非靶标病原真菌基因组 DNA进行常规 PCR 扩增，结果显示仅马铃薯粉痂病菌 DNA 扩增出 281 和 391 bp 的目的条带，而其它供试菌株 DNA 和清水对照未扩增出条带（图 2）

当土壤含量进一步增加到降低土壤透气性时，植物蒸腾强度会因为植物根系活性的下降而减弱。表明当光照强度大于1000mol/(m2s)时，植物为减少伤害，气孔被迫关闭，降低了青海云杉的蒸腾作用。

土壤含水量为14.53%时，青海云杉的水分利用效率最大。青海云杉的回归曲线的相关系数平方Ｒ2大于0.8，表明土壤水分含量与净光合速率之间有很高的相关性，曲线拟合程度很高。

植物只有在适宜的水分条件和合理的光照范围内，才能更好的生长发育。暗中叶片不进行光合作用，只有呼吸作用释放CO2。